基于纳米抗体-碱性磷酸酶融合蛋白的一步酶联免疫吸附分析法检测黄曲霉毒素B_1

编号：NMJS05725

篇名：基于纳米抗体-碱性磷酸酶融合蛋白的一步酶联免疫吸附分析法检测黄曲霉毒素B_1

作者：曹冬梅[1] ;许杨[1,2] ;涂追[1] ;李燕萍[2] ;熊亮[1,3] ;付金衡[2]

关键词：抗黄曲霉毒素B_1纳米抗体 碱性磷酸酶 融合表达 酶联免疫吸附分析

机构： [1]南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,南昌330047; [2]南昌大学中德联合研究院,南昌330047; [3]赣南医学院预防医学系,赣州341000

摘要： 从噬菌体展示的抗黄曲霉毒素B1（AFB1）纳米抗体文库中,通过四轮亲和淘选,得到抗AFB1纳米抗体G8。将编码纳米抗体G8的基因与碱性磷酸酶（AP）基因融合,构建了重组融合表达载体pET25b（＋）-G8-AP,将其转化大肠杆菌BL21（Rosetta,DE3）感受态细胞,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导融合基因表达。SDS-PAGE结果表明,融合蛋白G8-AP为可溶性表达,Ni^2＋-NTA亲和层析柱纯化融合蛋白,对硝基苯磷酸二钠（pNPP）法测得纯化后的G8-AP的碱性磷酸酶比活力为（364.5±8.3）U/mg。ELISA检测结果表明,G8-AP具有特异识别AFB1的活性,与其它真菌毒素（AFB2、AFG1、AFG2、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、伏马菌素B1）无交叉反应。基于G8-AP建立了检测AFB1的一步ELISA法。在优化的条件下,即甲醇浓度20%、盐离子浓度20 mmol/L、pH 7.4条件下,方法的半数抑制浓度（IC（50））为19.8 ng/mL,线性范围为4.3-92 ng/mL,检出限为2.6 ng/mL。对玉米和小麦样品加标回收实验结果表明,基质对本方法的干扰不明显,可用于实际样品检测。