pH响应的介孔二氧化硅纳米颗粒载PI3K/mTORi治疗结直肠癌的作用及机制研究

编号：YYHY00998

篇名：pH响应的介孔二氧化硅纳米颗粒载PI3K/mTORi治疗结直肠癌的作用及机制研究

作者：吴茜

关键词： 结直肠癌; 靶向治疗; 免疫检查点阻断疗法; 介孔二氧化硅纳米颗粒; 协同治疗;

机构： 四川大学

摘要： 研究背景与目的 免疫检查点阻断疗法（ICIs）通过阻断肿瘤表面抑制性受体与淋巴细胞表面的配体结合,阻断肿瘤细胞的免疫逃逸,激活淋巴细胞发挥抗肿瘤作用。该疗法在黑色素瘤、肺癌等癌症的治疗中已经显示出持久的抗肿瘤效果,但是在结直肠癌（CRC）中的治疗效果并不理想,将免疫检查点阻断疗法与别的治疗方法联用为提高结直肠癌患者的生存率带来新的希望。PI3K/AKT/mTOR信号通路调控肿瘤细胞的分裂、增殖,参与新陈代谢、肿瘤血管生成等过程。PI3K通路的异常激活发生在大多数实体瘤中,PIK3CA突变型结直肠癌患者复发风险高,预后不良,生存期较差。使用PI3K通路靶向抑制剂（PI3Ki）能将患者的复发率由30%降低到10%。将PI3K通路靶向抑制剂与免疫疗法联用的临床试验正在开展中,但由于PI3Ki对淋巴细胞的毒性作用为二者的联用提出了一定的挑战。因此利用纳米载药系统将PI3Ki靶向输送到肿瘤细胞内部,规避PI3Ki对淋巴细胞的毒性对实现靶向治疗与免疫检查点阻断疗法协同治疗结直肠癌具有重要意义。 实验方法与结果 1、PI3K/mTORi抑制肿瘤细胞生长的同时也会通过影响淋巴细胞PI3K/AKT/mTOR通路抑制淋巴细胞的增殖 PI3K/mTORi在用于肿瘤治疗时也会抑制淋巴细胞的正常增殖,影响免疫系统发挥正常的功能。本实验中,我们用不同浓度（0、0.0001、0.001、0.01、0.1、1μM）的PI3K/mTORi（BEZ235）处理结直肠癌细胞（CT26、MC38、HCT116）和淋巴细胞（EL4、Jurkat）72 h后,通过MTT检测药物对它们生长的影响。结果显示,BEZ235对肿瘤细胞的半数抑制浓度(IC50)在0.1μM左右,而淋巴细胞的IC50在0.01μM左右,说明淋巴细胞对BEZ235更为敏感。与此同时,我们还利用CFSE染色小鼠脾淋巴细胞,利用流式细胞仪检测CD8+T细胞的增殖情况,结果显示,BEZ235能明显抑制淋巴细胞的增殖能力,且随着药物浓度上升,淋巴细胞几乎失去了分裂增殖的能力。为了进一步验证BEZ235抑制肿瘤细胞和淋巴细胞生长的机制,我们通过免疫印迹法分析了不同浓度（0、0.0001、0.001、0.01、0.1、1μM）的BEZ235处理结直肠癌细胞（CT26、MC38、HCT116）和淋巴细胞（EL4、Jurkat）3 h后,对PI3K通路下游蛋白AKT、S6和4EBP1以及mTOR激酶磷酸化的影响。结果显示BEZ235在0.1μM时显著抑制肿瘤细胞和淋巴细胞AKT、S6、4EBP1以及mTOR蛋白的磷酸化水平。 2、构建pH可控、靶向肿瘤细胞的载PI3K/mTORi介孔二氧化硅纳米颗粒 为了规避BEZ235对淋巴细胞的毒性,我们设计了一种pH响应的能靶向肿瘤细胞的介孔二氧化硅纳米颗粒（MSNP-PAA-PEG-iRGD）。聚丙烯酸（PAA）是一类亲水性的聚合物,能够响应pH的变化,作为封堵“阀门”使药物装载在纳米颗粒孔道内,在肿瘤酸性环境中释放出来。聚乙二醇（mPEG）具有良好的生物相容性,常用于修饰纳米颗粒,使纳米颗粒在机体内不被巨噬细胞等清除。iRGD是肿瘤血管靶向肽,修饰在纳米颗粒表面使纳米颗粒能够更好地靶向肿瘤细胞。MSNP-PAA-PEG-iRGD的具体合成方法如下:首先利用溶胶凝胶法合成了模板化的介孔二氧化硅纳米颗粒（MSNP）;然后将BEZ235/FITC装载在MSNP孔道内,利用MSNP-NH2表面的氨基在水溶液中电离与聚丙烯酸（PAA）上的羧基发生静电吸附反应,将PAA修饰在MSNP-NH2表面,封堵孔道,合成MSNP-PAA;最后,利用酰化反应将氨基化的聚乙二醇（NH2-mPEG）和iRGD偶联在MSNP-PAA表面,合成MSNP-PAA-PEG-iRGD。同时,我们在合成过程中通过激光粒度分析仪（DLS）检测纳米颗粒的粒径,通过扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM）监测纳米颗粒的内外部结构,通过氮气吸附脱附仪检测纳米颗粒的孔径大小,通过傅里叶红外光谱仪（FTIR）对纳米颗粒表面聚合物进行表征。3、MSNP-PAA-PEG-iRGD的体内外生物分布 为了研究MSNP-PAA-PEG-iRGD特异性靶向肿瘤细胞的功能,我们将载FITC的MSNP-PAA-PEG-iRGD（MSNP-FITC）与肿瘤细胞（CT26、MC38、HCT116）和淋巴细胞（EL4、Jurkat）共孵育,利用流式细胞仪和共聚焦显微镜观察MSNP-FITC在细胞内的分布情况。给小鼠静脉注射MSNP-FITC,动物活体成像仪观察MSNP-FITC在小鼠体内分布情况。结果显示,纳米颗粒在体外能特异性靶向肿瘤细胞,在体内也能在肿瘤部位聚集,说明我们合成的纳米颗粒具有良好的肿瘤靶向性。 4、MSNP-BEZ235在体外保护淋巴细胞的增殖 为了研究载BEZ235的MSNP-PAA-PEG-iRGD（MSNP-BEZ235）在体外对肿瘤细胞和淋巴细胞生物活性的影响,我们通过MTT检测了MSNP-BEZ235对肿瘤细胞和淋巴细胞生长的影响,用免疫印迹法检测了MSNP-BEZ235对肿瘤细胞和淋巴细胞PI3K/AKT/mTOR通路的影响,用CFSE检测了MSNP-BEZ235对小鼠脾淋巴细胞增殖和功能的影响。结果显示MSNP-BEZ235在体外能通过抑制肿瘤细胞PI3K通路下游蛋白AKT、S6、4EBP1和mTOR的磷酸化水平抑制肿瘤细胞的生长,其抑制效果同游离BEZ235相当。对于淋巴细胞,在同样的药物浓度下,MSNP-BEZ235能明显缓解游离BEZ235对淋巴细胞的毒性,保护淋巴细胞的增殖。 5、MSNP-BEZ235联合Anti-PD-1抑制肿瘤生长同时促进肿瘤微环境中的免疫浸润 为了进一步评估MSNP-BEZ235在体内与Anti-PD-1协同的抗肿瘤效果。我们构建了小鼠结直肠癌动物模型,检测了BEZ235、MSNP-BEZ235、Anti-PD-1、BEZ235+Anti-PD-1和MSNP-BEZ235+Anti-PD-1对小鼠肿瘤生长的抑制情况以及对肿瘤微环境中浸润淋巴细胞的影响。结果显示,MSNP-BEZ235和MSNP-BEZ235+Anti-PD-1对肿瘤的抑制效果均分别优于BEZ235和BEZ235+Anti-PD-1,说明将药物装载在纳米颗粒,药物随着纳米颗粒聚集在肿瘤部位,增加了药物在肿瘤中的浓度,对肿瘤生长的抑制效果更好。与此同时,联合给药组对肿瘤生长的抑制效果均优于游离药治疗组,说明靶向药和免疫检查点阻断疗法协同能增加抗肿瘤效果。另外,通过CD8+T细胞与凋亡细胞（Tunel）的共染,证明将PI3K/mTORi装载在纳米颗粒内部能规避淋巴细胞毒性,减少肿瘤内部淋巴细胞的凋亡。 实验结论 我们在体外验证了PI3K/mTORi对淋巴细胞生长和增殖的抑制作用,并成功构建了pH响应靶向肿瘤细胞的介孔二氧化硅纳米颗粒MSNP-PAA-PEG-iRGD;验证了MSNP-PAA-PEG-iRGD在体内外具有肿瘤特异性靶向功能;验证了MSNP-BEZ235在体外能抑制肿瘤细胞生长的同时保护淋巴细胞的增殖;验证了PI3K/mTORi与Anti-PD-1协同治疗结直肠癌;阐释了PI3K/mTORi与Anti-PD-1协同治疗结直肠癌,规避淋巴细胞毒性的机制。