010-82930964 
编号：YYHY00997
篇名：抗菌肽L-K6修饰的介孔纳米二氧化硅递送siRNA载药体系对乳腺癌细胞作用机制的研究
作者：吴晓雪
关键词： 阳离子抗菌肽; 介孔纳米二氧化硅; 乳腺癌; siRNA递送;
机构： 辽宁师范大学
摘要： 乳腺癌的治疗仍然存在着肿瘤选择性低,靶向性不足,易产生多药耐药等问题,功能化修饰的无机纳米载体在抗肿瘤治疗中的应用越来越受到关注,其中,多肽修饰的纳米载药体系在提高药物稳定性和肿瘤细胞靶向性等方面具有一定的优势。本课题组前期研究结果,L-K6是一种具有α-螺旋结构的阳离子抗菌肽,对乳腺癌细胞具有选择性,能够穿膜进入细胞核,并且降低耐药。若L-K6作为配体修饰构建纳米载药体系,则有望在提高药物递送靶向性及降低耐药等方面发挥重要作用。本论文将选取30nm介孔二氧化硅(mesoporous silica nanoparticle,MSN)为药物载体,装载靶向凋亡抑制基因Survivin的Sur.siRNA,阳离子聚合物PEI(Polyetherimide)连接L-K6作为配体进行修饰,构建MSN-Sur.siRNA@PEI-L-K6纳米载药体系,优化合成比例,进行性质表征,并对其在乳腺癌细胞中的siRNA递送效果、抗肿瘤机制和耐药逆转活性进行研究。 首先,我们在3条Sur.siRNA中选择对乳腺癌细胞Survivin基因干扰效果最佳的序列,装载构建MSN-Sur.siRNA@PEI-L-K6,并对纳米载药体系进行N/P的优化和性质表征。N/P是PEI中氮(N)和寡核苷酸中核苷酸磷酸盐(P)的比,我们合成了不同N/P(1:1、2:1、4:1、6:1、8:1)的MSN-Sur.siRNA@PEI-L-K6,N/P为6:1时,纳米粒度和Zeta电位分析仪检测到MSN-Sur.siRNA@PEI-L-K6的粒径最小为94.16±2.08nm;Zeta电位为33.43±0.40m V;琼脂糖凝胶电泳实验结果显示,MSN@PEI-L-K6可以结合Sur.siRNA,且保护Sur.siRNA不会被RNA酶降解,因此确定最佳合成比为N/P为6:1。热重分析实验显示,载药体系中配体PEI-L-K6的总上载量为41.50%;圆二色光谱实验显示,L-K6修饰后,MSN-Sur.siRNA@PEI-L-K6载药体系依然保持了该肽原有的α-螺旋二级结构;扫描电镜观察发现,载药体系外观形貌为大小均匀的圆球形,粒径约为50nm,稍有团聚,使纳米粒度仪无法检测到单个的载药体系颗粒导致粒径结果偏大;MSN-Sur.siRNA@PEI-L-K6在人血清中孵育96 h内,其粒径无明显变化,说明具有一定的稳定性;溶血实验结果显示,MSN-Sur.siRNA@PEI-L-K6浓度在40μg/m L以下时,溶血率均低于5%,较为安全。综合以上结果,优化N/P比例构建的MSN-Sur.siRNA@PEI-L-K6载药体系在装载、合成与性质等方面都较为稳定。 其次,我们将构建的MSN-Sur.siRNA@PEI-L-K6载药体系作用于人乳腺癌MCF-7、MCF-7/Adr细胞,对其Sur.siRNA递送能力和抗肿瘤机制进行研究。CCK-8法检测结果显示,N/P为6:1时,MSN-Sur.siRNA@PEI-L-K6载药体系对MCF-7、MCF-7/Adr细胞的抑制能力最强,IC50分别为16.79±3.82μg/m L和22.77±2.18μg/m L;膜电位和膜通透性检测结果表明,MSN-Sur.siRNA@PEI-L-K6载药体系以非破膜的方式进入细胞;RT-qPCR和Western-blot实验结果显示,MSN-Sur.siRNA@PEI-L-K6载药体系分别从蛋白水平和基因水平有效降低Survivin蛋白和Survivin基因的表达;流式细胞仪检测转染效率的实验结果显示,FAM荧光标记siRNA的MSN-FAM-siRNA@PEI-L-K6载药体系可提高FAM-siRNA的细胞转染效率,是FAM-siRNA的10倍;流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示,MSN-Sur.siRNA@PEI-L-K6能诱导MCF-7、MCF-7/Adr细胞发生凋亡,凋亡率分别为58.17%和55.27%;荧光酶标仪检测凋亡信号蛋白Caspase9、Caspase3活性,结果表明MSN-Sur.siRNA@PEI-L-K6可激活Caspase9和Caspase3。 最后,我们考察了载体MSN@PEI-L-K6对耐药乳腺癌MAF-7/Adr细胞耐药性的影响。流式细胞仪结果显示,MSN@PEI-L-K6能够有效提高化疗药阿霉素DOX(doxorubicin,DOX)在MCF-7/Adr细胞内的滞留,增加细胞对P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gP)底物Rho123的摄取,抑制外排功能,且能降低P-gP的表达,说明修饰在载体上的L-K6仍具备逆转MCF-7/Adr细胞耐药的活性。 综上所述,我们有效合成了50nm左右的MSN-Sur.siRNA@PEI-L-K6,性质较为稳定安全;可被乳腺癌MCF-7、MCF-7/Adr细胞摄取,能够有效递送siRNA进入细
