负载反义vicR的介孔二氧化硅纳米粒调控变异链球菌致龋性的研究

编号：YYHY00995

篇名：负载反义vicR的介孔二氧化硅纳米粒调控变异链球菌致龋性的研究

作者：田雨婷

关键词： 生物膜; 胞外多糖; 致龋性; 介孔二氧化硅纳米粒; 变异链球菌;

机构： 四川大学

摘要： 背景:龋病是发生于牙齿硬组织的慢性进行性的感染性疾病。变异链球菌（S.mutans）被证明是口腔中主要的致龋菌,具有产酸、耐酸和形成生物膜的能力。变异链球菌以环境中的蔗糖为底物所合成的胞外多糖（EPS）是生物膜的主要成分及重要的致龋毒力因子。因此,靶向干扰胞外多糖的合成有望成为防治龋病的有效手段。 Vic RK是变异链球菌必需双组份信号转导系统（TCSTS）,与变异链球菌的EPS合成和粘附力有关。本课题组前期研究中发现了一条非编码反义RNA分子能够抑制vicR的表达,并将其命名为antisense vicR RNA（ASvicR）。此外,ASvicR被证实可有效干扰vicR的表达,抑制EPS的合成,妨碍生物膜的形成,从而降低变异链球菌致龋性。这些研究结果表明ASvicR有望成为龋病早期防治的靶向生物分子。课题组前期已成功构建含ASvicR序列的重组质粒（plamid-ASvicR,pASvicR）,但裸露的pASvicR易被核酸酶水解,若想实现其临床应用转化,需构建一种能够负载和保护重组质粒并促进其转化的载体。 树枝状介孔二氧化硅纳米粒（DMSNs）因其具有放射状大孔道结构,较大的比表面积和孔隙率,较好的入胞性能和生物可降解性,能够携载空间位阻较大的生物学分子如蛋白质、核酸等,在药物传递系统中有着极大的优势。DMSNs表面富含羟基使得其表面带负电荷,为了负载表面同样带负电荷的核酸分子,需对DMSNs表面进行氨基化改性而使其带正电荷。 目的: 1.合成并改性DMSNs以得到氨基化树枝状介孔二氧化硅纳米粒（DMSNs-NH2）。 2.探究DMSNs-NH2负载、保护以及递送pASvicR的能力;并探究DMSNs-NH2负载pASvicR后（DMSNs-NH2-pASvicR）的细胞毒性。 3.探究DMSNs-NH2-pASvicR对变异链球菌致龋性的调控作用。 方法: 1.使用水油双相分层法合成DMSNs后对其进行氨基修饰得到DMSNs-NH2;利用能谱仪（EDS）配合透射电镜（TEM）、氮气吸-脱附测试、纳米粒度电位仪等对纳米颗粒进行表征。 2.通过绘制负载曲线、琼脂糖电泳、DNase I酶切保护实验、Zeta电位测试以及EDS面扫来分析DMSNs-NH2负载和保护pASvicR的能力;利用抗性平板筛选和GFP表达实验来验证DMSNs-NH2递送pASvicR进入变异链球菌的能力;通过CCK-8和死活细胞染色评估DMSNs-NH2-pASvicR对人牙龈成纤维细胞（HGFs）的细胞毒性。 3.利用扫描电镜（SEM）观察各组生物膜形态结构;利用激光共聚焦显微镜（CLSM）分析各组生物膜EPS量和菌量以及两者间的比例;通过实时荧光定量聚合酶链反应（q RT-PCR）揭示DMSNs-NH2-pASvicR对vicR表达的影响;构建大鼠龋病模型,通过体视显微镜观察和Keyes评分探究DMSNs-NH2-pASvicR对变异链球菌体内致龋性的影响。 结果: 1.成功合成了粒径约60 nm,孔径约8 nm,平均Zeta约+6 mV,比表面积约449.1 m2g-1和孔体积约0.8 cm3g-1的分散性良好的DMSNs-NH2。 2.DMSNs-NH2能够成功负载pASvicR并具有保护pASvicR免受DNase I降解的能力;当DMSNs-NH2与pASvicR质量比为80时,92%的pASvicR能被负载;负载在DMSNs-NH2上的pASvicR能进入变异链球菌UA159并成功表达;DMSNs-NH2-pASvicR对HGFs无明显毒性。 3.SEM结果显示DMSNs-NH2-pASvicR组的生物膜缺乏网络交联的三维结构,暂未观察的菌体本身的形态结构异常;CLSM结果显示DMSNs-NH2-pASvicR组生物膜的菌量无明显变化,然而EPS量及糖菌比降低（P<0.0001）;qRT-PCR结果显示DMSNs-NH2-pASvicR组的vicR表达下降明显（P<0.0001）;大鼠下颌磨牙的体视显微镜图片显示DMSNs-NH2-pASvicR组无明显龋坏或仅有少量浅龋,Keyes总评分显著低于对照组（P<0.01）。 结论: 综上所述,DMSNs-NH2适合作为递送pASvicR进入变异链球菌的载体。DMSNs-NH2-pASvicR能够靶向抑制变异链球菌生物膜的形成、降低变异链球菌的致龋性。DMSNs-NH2-ASvicR有望在未来进行临床转化,成为一种新型防龋药物,并且可以为探索其它能够靶向抗菌并维持微生态平衡的药物提供思路。