介孔硅纳米粒接枝白藜芦醇在糖尿病牙周炎治疗的探索研究

编号：YYHY00992

篇名：介孔硅纳米粒接枝白藜芦醇在糖尿病牙周炎治疗的探索研究

作者：谭裕洁

关键词： 糖尿病牙周炎; 白藜芦醇; 介孔硅纳米粒; 巨噬细胞极化; 免疫调控;

机构： 四川大学

摘要： 背景: 糖尿病牙周炎（Diabetic periodontitis,DP）发病率高、病程长、病症重,已成为口腔临床亟待解决的难题之一。目前常规的治疗主要是采用全身降糖联合牙周基础治疗的策略,但大量临床结果显示,该策略不仅在局部抗炎以及修复缺损组织等方面表现欠佳,同时对患者血糖代谢能力的调控作用有限,而且该治疗方式涉及了抗生素的应用,容易产生耐药性,不利于后续治疗。现研究者普遍认为DP的治疗应兼具长效局部抗炎、保护牙周软硬组织以及改善机体血糖代谢的特点。通过抑制促炎亚型巨噬细胞（Pro-inflammatory macrophages,M1）形成,同时促进组织修复亚型巨噬细胞（Tissue repair macrophages,M2）转变的宿主免疫调控疗法（Host-modulation therapy,HMT）被认为是治疗牙周炎的理想策略,如何筛选出合适的药物模型是HMT获得良好效果的关键。天然小分子白藜芦醇（Resveratrol,RSV）兼具抗炎、抗氧化以及提升机体胰岛素敏感性的功能,因此理论上可作为经由HMT治疗DP的候选药物。但RSV存在水溶性差、代谢迅速和血浆半衰期短等缺点,限制了它在临床上的应用,因此需要通过特殊载药手段提升其稳定性,延长其药理作用。基于上述背景,本研究首先利用化学接枝方法成功获得携载RSV的介孔硅纳米粒（RSV-grafted mesoporous silica nanoparticles,MSN-RSV）,随后通过一系列检测手段系统评价其理化性能、药物稳定性以及细胞毒性等。接下来建立DP大鼠模型,并评估MSN-RSV在牙周袋局部应用后对DP的作用效果。此外,本课题深入分析了MSN-RSV对巨噬细胞极化行为的调控作用,并初步探索了相关的分子机制。最后,考虑到糖尿病与牙周炎之间具有明确的双向关系,本实验在确证了MSN-RSV能够减轻DP炎症的前提下,进一步研究了材料联合胰岛素对II型糖尿病（Type II diabetes mellitus,T2DM）关键指标——胰岛素抵抗（Insulin resistance,IR）和糖代谢的影响。 方法: 本研究采用三步法合成MSN-RSV,分以下四个实验进行深入研究: 1.实验一首先通过扫描电镜（Scanning electron microscopy,SEM）、透射电镜（Transmission electron microscopy,TEM）、傅里叶红外光谱（Fourier-transform infrared spectroscopy,FTIR）、Zeta电位测量、紫外可见吸收光谱（Ultraviolet and visible absorption spectrum,UV-Vis）、X射线光电子能谱技术（X-ray photoelectron spectroscopy,XPS）和核磁共振碳谱(Carbon-13 nuclear magnetic resonance spectrometry,13C-NMR)表征材料外观形貌和接枝过程。然后通过采集上清游离药物分析MSN-RSV在水溶液的接枝稳定性并考察了MSN-RSV在模拟唾液中的释放行为。通过1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH）清除实验表征材料的抗氧化性。采用细胞计数试剂（Cell counting kit-8,CCK-8）和采集细胞摄取纳米粒的TEM图像表征材料的细胞毒性。最后通过流式细胞技术和荧光图像评估细胞的摄取MSN-RSV的效率。 2.实验二首先通过联合应用高糖高脂饲料喂养、小剂量链脲霉素注射（Streptozotocin,STZ）以及丝线结扎上颌第二磨牙的方法构建大鼠DP模型。模型构建成功后以局部注射形式给药,收集颌骨标本通过Micro-CT扫描、抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate-resistant acid phosphatase,Trap）染色、苏木素&伊红（Hematoxylin and eosin,H&E）染色和Masson染色,评估MSN-RSV抗炎作用对缓解骨吸收和牙周纤维破坏的影响,并对巨噬细胞M1型、M2型特异标记物进行免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）染色分析和免疫荧光（Immunofluorescence,IF）染色分析,评估MSN-RSV对巨噬细胞极化行为的影响。 3.实验三用牙龈卟啉单胞菌来源脂多糖（Porphyromonas gingivalis-derived lipopolysaccharide,P.g.-LPS）作为炎症刺激同时结合高糖培养条件模拟DP微环境。通过实时荧光定量聚合酶链式反应（Quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-q PCR）和酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测RAW264.7巨噬细胞极化亚型相关m RNA表达和细胞因子分泌情况。然后通过流式细胞术检测不同亚型阳性细胞比例并通过IF和免疫印迹试验（Western blot,WB）检测特异性蛋白表达,分析MSN-RSV对巨噬细胞极化的影响。最后通过检测与极化相关的信号通路,研究MSN-RSV调控免疫反应的分子机制。 4.实验四应用DP大鼠定期规律皮下注射胰岛素进行全身血糖控制,同时牙周注射MSN-RSV进行局部牙周治疗。通过表征血浆胰岛素（Plasma insulin level,PIL）和胰岛素抵抗指数（Homeostasis model assessment of insulin resistance index,HOMA-IR）评估MSN-RSV辅助治疗对IR的影响,借助ELISA、IHC和IF手段分析炎症因子及IR相关信号分子在牙周组织和血浆中的表达差异,以及通过腹腔注射葡萄糖耐受实验（Glucose concentration obtained from intraperitoneal glucose tolerance test,IPGTT）和检测糖化血红蛋白（Glycated hemoglobin,GHb）含量,明确该治疗方式对糖代谢能力的作用。 结果: 1.本课题经过三步法将RSV稳定接枝在介孔硅纳米粒子上,接枝量为（33.73±0.61）%。该体系具有低细胞毒性,与RSV相比,MSN-RSV能够持续发挥清除DPPH自由基的作用,并能提高细胞对药物的摄取效率。 2.MSN-RSV可通过减少巨噬细胞向M1极化同时促进M2生成实现持续抗炎效果,对比其他处理组,最大程度减少了DP大鼠的牙周组织破坏。 3.MSN-RSV能够持续地减少M1相关促炎因子如肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）、IL-6和诱导型一氧化氮合酶（Inducible nitric oxide synthase,i NOS）的表达,并增加M2相关抗炎细胞因子精氨酸-1（Arginase-1,Arg-1）和IL-10的表达,参与炎症抑制和免疫调控。MSN-RSV还能以剂量依赖形式抑制核因子激活的B细胞的κ-轻链增强子p65亚基磷酸化(Phosphorylated-nuclear factor-kappa B（NF-κB）p65,p-p65)、NF-κB抑制蛋白磷酸化（Phosphorylated-NF-κB inhibitor,p-IκB）和信号转导及转录激活因子-3磷酸化（Phosphorylated-signal transducer and activator of transcription-3,p-STAT3）,并且增加沉默信息调节因子1（Silent information transcription regulator 1,SIRT1）和磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（Phosphorylated-AMP-activated protein kinase,p-AMPK）的表达。 4.MSN-RSV与胰岛素联合能显著改善糖尿病大鼠的PIL和HOMA-IR,减少TNF-α在牙周组织中的表达和血浆中的含量,并能显著提高牙周组织中SIRT1和AMPK的表达水平,但对IPGTT、GHb的影响没有统计学意义。 结论: 介孔硅作为载体提高了RSV的稳定性和细胞摄取效率,延长了药效时间,并可持续有效抑制巨噬细胞向M1极化的同时加速M2的极化。其原因可能与AMPK/SIRT1信号通路被激活和NF-κB/STAT3信号通路被抑制有关。MSN-RSV与胰岛素联合应用后,DP大鼠的IR得到明显改善,但糖代谢能力与对照组相比没有显著变化。 综上所述,本研究证实将RSV化学接枝在MSN上可有效提升药物稳定性,所得产物MSN-RSV能够通过免疫调控的方式持续有效地减轻糖尿病影响下的 牙周炎炎症状况,为DP治疗提供了一种切实可行的策略,也为RSV相关药物载体的开发提供支持。同时,研究还关注了材料与胰岛素联合使用后对机体糖尿病关键指标——IR以及糖代谢能力的影响,为后续深入揭示牙周炎与糖尿病之间的相互作用机制提供一定的理论依据。